• 免疫印迹实验步骤及问题解决

    信息来源：k8.com 作者：genecreate 发布时间：2019-01-21 16:43:54

    一、实验步骤
    试剂和缓冲液
    1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris， 150 mM NaCl， 0.1% SDS， 0.5% SDS， 1% Triton X-100 或NP40.
    1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 2.7 mM Na2HPO4， 2.7 mM KH2PO4， pH 7.4
    BCA或Bradford蛋白分析试剂盒
    1.5 M Tris缓冲液 （pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O， 500 ml溶液pH调节到8.8
    1.0 M Tris缓冲液 （pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O， 500 ml溶液pH调节到6.8
    10% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。 用前准备
    10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。
    1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris， 230 mM 甘氨酸 （pH 8.3）， 0.1% SDS。
    3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8）， 6% SDS， 30% 甘油， 30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝
    1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl， 0.05% Tween-20， 0.001% 硫柳汞
    1x 转移缓冲液: 3 g Tris， 14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L
    样品准备
    细胞培养样品
     
    贴壁细胞
    去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基
    加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。 在冰上孵育5-10 min。
    完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。
    （可选）充分混匀或超声处理。
    4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清
    总蛋白用前需储存在-20°C。
     
    悬浮细胞
    （可选）取出100 ul细胞培养也进行细胞计数。
    将细胞转移到预冷的1.5 ml或15 ml离心管2000 rpm 4°C离心5 min。
    去除培养基并用1 ml预冷的1x PBS重悬细胞，然后转移到1.5 ml离心管中。
    2000 rpm 4°C离心5 min。
    用1 ml预冷的RIPA 缓冲液/107细胞重悬细胞
    细胞悬液在冰上孵育并摇床30 min，或充分混匀或超声处理。
    4°C 12000 rpm离心10-15 min收集上清备用。
    总蛋白需要在用前储存在-20°C 。
     
    组织
    组织准备和定量。将组织切成小块。
    加入500-600 ul预冷的1x RIPA缓冲液/100 mg 组织。
    将组织充分混匀
    4°C 12000 rpm离心15-20min。
    收集上清。
    总蛋白在用前应储存在-20°C。
     
    蛋白定量
    Bradford分析和BCA分析请查看来邦的综述 蛋白定量。
     
    SDS-PAGE
    聚丙烯酰胺凝胶
    6%-15% 分离胶上注入5%的浓缩胶并插上梳子（10或者15孔）。
    分离胶浓度（%） 蛋白大小范围（kDa）
    8 25-200
    10 15-100
    12.5 10-70
    15 12-45
    20 4-40
    表1： 蛋白分离范围由分离胶浓度决定。
     
    上样和电泳
    2X SDS蛋白上样缓冲液与蛋白样品1:1充分混匀。
    注胶前先将样品在50-60°C预热。预染Marker可用于监控蛋白分离和转移效率。
    在1X Tris-甘氨酸缓冲液在60-120V跑电泳1-3小时
    分离胶（10ml） 浓缩胶（3ml）
      6% 8% 10% 12% 15% 6%
    H20 5.3 4.6 4.0 3.3 2.3 2.1
    30% 丙烯酰胺混合物* 2.0 2.7 3.3 4.0 5.0 0.5
    1.5M Tris（pH 8.8） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 1.0M Tris （pH 6.8） 0.38
    10% SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.03
    10% APS 0.1 0.1 0.1 .1 0.1 0.03
    TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 0.003
    表2：分离胶（10ml）和浓缩胶（3ml）的制备方案
     
    蛋白转移
    将蛋白转移到PVDF或NC*膜上进行抗体检测
    1.将电泳材料，如胶、whatman纸和海绵放入1X转移缓冲液中预先浸润.
    2.PVDF膜应在甲醇中预先孵育10秒到1分钟，然后移入转移缓冲液中
    3.将材料按如下顺序放置:板（黑色面）， 海绵， Whatman纸， 胶， 膜， Whatman纸， 海绵， 板（亮面）.
    4.将转移装置安置好，黑色面对应黑色电极。
    5.转移到冷的1X转移缓冲液中.电转电流和时间应该根据电泳装置的厂家说明推荐设置。
    * NC膜不能用甲醇孵育。
     
    将膜放入溶有5%脱脂奶粉的1x TBST中25°C孵育1小时 （或在摇床上4°C孵育过夜）。
    抗体孵育
    1.按照推荐浓度或根据结果优化浓度，将一抗溶于1X TBST+3% BSA中。
    2.在4°C孵育过夜或更长时间，或者在室温下4小时。
    3.回收一抗，保存在4°C。然后在室温下在摇床上冲洗膜三次，每次5-10 min。
    4.将二抗放入1X TBST中稀释，然后室温下孵育膜1小时，或4°C摇床上2-4小时。
    5.在室温摇床上用TBST洗三次，每次10 min
    ECL+ 系统和X-ray胶卷被用于HRP标记的二抗。
     
    二、问题解决
    没有信号，可能原因
    检测的二抗用错了（明确一抗制备的宿主）
    一抗或二抗的浓度太低（提高浓度再试一次）
    一抗不能识别检测物种的蛋白（检查一抗的特异性）
    上样蛋白量太少（增加样品的量）
    转移效率太低（改进转移实验步骤。确保PVDF膜用之前用甲醇预孵育）
    一抗已经被用很多次了（使用重新稀释的一抗）
    封闭时间太长或者洗涤次数太多（减少封闭时间和洗涤次数）
    检测试剂盒失效（加入阳性对照并确保试剂盒有效）
    叠氮化钠可能抑制二抗（溶解缓冲液中应避免使用叠氮化钠）
    一抗或二抗的孵育时间太短（延长孵育时间）
     
    背景太亮
    封闭时间太短或者封闭缓冲液有问题（延长封闭时间或者用BSA代替脱脂奶粉）。
    一抗或二抗浓度太高。（降低抗体浓度）
    洗脱不充分（增加洗脱次数）
    孵育温度太高 （确保一抗在4°C孵育）
    膜使用错误或者膜已经干了 （避免膜变干）
     
    白色条带或者信号消失很快
    一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
     
    条带弯曲
    电泳电压太高，或者电泳过程中缓冲液温度太高。（降低电压，电泳缓冲液置于冷的环境中）
     
    条带弥散
    一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
    上样蛋白量太大 （降低上样量）
     
    空白区域
    转移不均衡（确保膜均衡的贴到胶上，没有气泡）
    非特异性信号
    一抗或二抗浓度太高（降低抗体浓度）
     
    条带脏或者模糊
    平衡时间不够，或者胶与膜的接触不均衡。（确保胶没问题，改进转移步骤）
     
    秃斑
    胶与膜之间有气泡（确保胶与膜之间没有气泡）
     
    条带大小与理论不符
    一抗特异性差（更换一抗）
    一些蛋白可能移动与理论大小差别较大。
     
    不能阐释可能的翻译后修饰
    翻译后修饰例如多聚（ADP-核糖基）-PAR链（它能够介导蛋白分子带负电荷）不能通过SDS-PAGE分别。 不过它们能通过CTAB-PAGE分开。 CTAB， 溴化十六烷基三甲基铵 （(C16H33）N(CH3)3Br， cetyltrimethylammonium bromide， hexadecyltrimethylammonium bromide）是一种基于氨阳离子的表面活性剂。
     



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