• 肽键的稳定性案例个人解读

    信息来源：k8.com 作者：genecreate 发布时间：2018-07-18 15:03:12

            前两天一个北京的朋友问到肽键的稳定性问题，他想知道在还原剂的条件下肽键是不是不稳定，因为他的蛋白在非还原电泳中是28kDa, 以及部分14kDa, 在还原性电泳中是14kDa的均一条带。今天借朋友的图来说一下肽键的稳定性。
     
    （1）蛋白质的耐热性能和一级结构关系不大，更多的都是在高温下，高级结构破坏疏水面暴露以后，聚集沉淀。比如一个鸡蛋，即使咱们做成了鸡蛋花汤，如果用SDS-loading buffer 溶解以后，大部分蛋白的都还保持一级结构的完整性。
     
    （2）但是（1）这个说法并不严格，我们知道煲汤的时候，只要时间到位了，汤就可以变的鲜美，这事实上是蛋白质多肽链的水解，释放出氨基酸以及其它一些小分子的原因。也就是说蛋白质的肽链只要煮的足够久，最终也会被打断，温度越高降解的越快（中国式油煎蛋就比西方的冷锅扒蛋要味道好）。
     
    （3）通常情况下肽键要比二硫键要稳定。下面这个图显示了，在没有还原剂的情况下50度，80度，100度煮样5分钟，都可以造成部分二硫键的打开，温度越高打开比例越多。可见，即使在100度的非还原loading buffer中，二硫键的打开速度还是挺慢的，肽键断裂的速度也就更慢了，在下图中，基本上五法看到肽键的水解组分。
     
    （4）许多实验室sds电泳样品处理条件是：98-100度煮3-5分钟，我们通过下图可以知道，在这个条件下，蛋白的肽链还是稳定的。且大部分情况下，80度加热和100度加热并没有多少条带上的差异。但是为何有人的电泳就结果很漂亮，条带很sharp, 有些人的电泳就很糊呢？
     
    （5）下图的最后一个lane说明在还原剂中，5分钟煮样可以完全打开二硫键，但是如果你的还原剂质量差，那么会出现还原剂和蛋白之间发生再次交联，也就是已经寡聚的还原剂和蛋白质上的巯基再次交联在一起，此时的交联是非特异的，条带就会变糊。这就是为何我反复和兄弟们说还原剂要用TCEP的原因。
     
    （6）当然，电泳糊还有很多其它原因，比如你用的甘氨酸，tris体系里面的纯度。有些实验室喜欢重复回收使用甘氨酸running buffer, 其实完全没有必要。通常用来电泳的甘氨酸质量已经不太好，室温放置很容易变粘（具体原因我也不清楚），这样的缓冲液结果不会好。太差的甘氨酸里面杂质太多，在电泳胶的上端压缩胶中的时候就有问题，进入分离胶就会出现离子对不平衡，扩散的厉害。这个就不深入讨论了。

     
    （7）最后，祝大家好好煲汤，只有汤做的好，电泳才能做的好，因为原理大约雷同。一个好厨师，也一定可以成为一个好的蛋白纯化大师。
     



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